PCR (araştırma) - uygulama. PCR tekniği nedir?

PCR, pek çok hastalığın teşhisinde kullanılan bir testtir. PCR yöntemi, organizmada bakterilerin doğrudan varlığını ve özellikle DNA'sını göstermeye izin verir. PCR testi diğerleri arasında kullanılır Lyme hastalığının tanısında. PCR tekniği nedir? Gerçek zamanlı PCR nedir?

İçindekiler:

1. PCR (test) - PCR tekniği nedir?
2. PCR (araştırma) - PCR yönteminin uygulanması
3. PCR (araştırma) - Lyme hastalığı
4. PCR (araştırma) - sonuçlar. Yanlış pozitifler olabilir mi?
5. PCR (araştırma) - sonuçlar. Yanlış negatif olabilirler mi

PCR (polimeraz zincir reaksiyonu), genetik ve moleküler laboratuvarlarda kullanılan temel yöntemdir. 1983 yılında, 1993 yılında Nobel Ödülü'ne layık görülen Kara Mullis tarafından geliştirildi.

PCR tekniğinin neyle ilgili olduğunu duyun. Bu, İYİ DİNLEME döngüsünün malzemesidir. İpuçları içeren podcast'ler.

Bu videoyu görüntülemek için lütfen JavaScript'i etkinleştirin ve HTML5 videoyu destekleyen bir web tarayıcısına geçmeyi düşünün

PCR (test) - PCR tekniği nedir?

PCR testi, polimeraz enzimi kullanılarak Borrelia proteinlerini kodlayan genler gibi spesifik bir DNA parçasının çoklu amplifikasyonundan (genellikle 30-40 döngüde) oluşur.

Ardından, büyütülmüş DNA parçasını görünür kılmak için özel moleküler boyalar kullanılır. Spesifik DNA fragmanlarının amplifikasyonu nedeniyle PCR, ultra duyarlı bir yöntemdir.

PCR yönteminde DNA fragmanları, bakteriyel DNA'nın belirli bir bölgesi için spesifik primer çiftleri kullanılarak amplifiye edilir. Örneğin, Lyme hastalığının teşhisinde kullanılan PCR'deki hedef bölgeler, proteinleri kodlayan genlerdir, ör. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Testin yapılabileceği biyolojik materyal:

• kan
• göç eden bir eritemden bir cilt bölümü
• Beyin omurilik sıvısı
• sinoviyal sıvı veya eklem kıkırdağından
• idrar

PCR (araştırma) - PCR yönteminin uygulanması

PCR yöntemini kullanarak Lyme borreliosis teşhisine ek olarak, diğer mikroorganizmaların veya insanların spesifik DNA fragmanlarını tespit etmek mümkündür. Bu nedenle, PCR yöntemi aşağıdakilerde de kullanılır:

• viral enfeksiyonların teşhisi ve izlenmesi: herpesvirüsler (herpes virüsü, herpes zoster, Epstein-Barr, sitomegalovirüs), HIV, hepatit virüsleri (HBV ve HCV)
• bakteriyel enfeksiyonların teşhisi ve izlenmesi, özellikle kültür yoluyla tanımlanamayan bakteriler, örneğin tüberküloz
• neoplastik hastalıkların teşhisi ve izlenmesi: lösemi, meme kanseri, kolorektal kanser, akciğer kanseri
• kanser yatkınlığının teşhisi: meme ve yumurtalık kanseri (BRCA1 ve BRCA2 genleri), kolorektal kanser (APC ve CHEK2 genleri)
• genetik hastalıkların teşhisi: hemokromatoz (HFE geni), talasemi (HBA1 ve HBA2 genleri), çölyak hastalığı (HLA genleri)
• Çocuğun ve babanın DNA uyumluluğunu tespit eden babalık testleri

Ayrıca okuyun: Lyme hastalığı testleri - neye benziyorlar ve Lyme hastalığı testleri Western Blot testi ve Lyme hastalığı. Test sonuçlarının yorumlanması Kene kaynaklı hastalıklar: borreliosis, babesiosis, bartonellosis, TBE ve diğerleri.

Şu anda, PCR yönteminde birçok değişiklik var. Örneğin, Lyme borreliosis tanısında esas olarak iç içe PCR ve real-time PCR kullanılmaktadır. İkincisi, kantitatif bir yöntemdir ve test edilen biyolojik materyaldeki Borrelia DNA kopyalarının tam sayısının belirlenmesine izin verir.

PCR (araştırma) ve Lyme hastalığı

Serolojik testler, Lyme hastalığının teşhisinin temelidir. Bununla birlikte, bu testlerin yanlış negatif olmasına neden olabilecek klinik durumlar vardır:

• serolojik pencere, yani vücudun Borrelia spiroketlerine karşı henüz spesifik IgM ve IgG antikorları üretmediği ilk enfeksiyon dönemi
• Yeterli antikor üretmeyen bağışıklık yetmezliği olan kişilerde
• Borrelia spiroket antijenleri ve bunlara özgü antikorlardan oluşan immün komplekslerin varlığı ve antikorların serolojik yöntemlerle tespitini engellemesi

Hastada Lyme hastalığı semptomlarından şüpheleniliyorsa ve serolojik test sonuçları negatifse PCR yöntemine dayalı moleküler testler yapılabilir.

Borrelia spiroketlerinin DNA'sı, vücut sıvılarındaki spiroket sayısı en yüksek olduğu için enfeksiyonun erken aşamasında tespit edilebilir.

Lyme borreliosis tanısında öncelikle ELISA gibi serolojik yöntemler kullanılır, ancak bazı klinik durumlarda PCR yöntemi kullanılarak yapılan genetik testler yardımcı olur.

Enfeksiyondan ne kadar uzun süre geçerse, bakteriyel DNA'yı tespit etme olasılığı o kadar azdır. Bu nedenle bazı durumlarda PCR testi yapılmadan önce 1-2 hafta özel ortamda bakteriler büyütülür ve ardından test yapılır.

Bu yaklaşım, Lyme hastalığı şüphesi ve toplanan beyin omurilik sıvısı durumunda kullanılır. Enfeksiyonun geç evresinde ELISA testi yapmak daha uygundur.

Polonya'da Borrelia burgdorferi çeşitlerinin oluşumuna ilişkin standardizasyon eksikliği nedeniyle, Lyme borreliosis'in rutin tanısında PCR yöntemi kullanılmamalıdır.

Ancak tanıda zorluk yaşanması durumunda (özellikle hastalığın erken evresinde) PCR testinin sonucu teşhis sürecine yardımcı olur.

Pozitif bir test sonucu, test edilen materyalde Borrelia burgdorferi DNA'sının ve çeşitlerinin varlığının tespit edildiği anlamına gelir, ancak vücutta aktif bir enfeksiyon olup olmadığını açıklamaz. Öte yandan, olumsuz bir sonuç vücutta bakteri varlığını dışlamaz.

Bazı laboratuvarlar kenede Borrelia DNA'sının varlığını test eder. Bununla birlikte, böyle bir incelemenin sonucu, ısırılan bir kişide Lyme hastalığının teşhisinin temeli değildir.

Önerilen makale:

ELISA testi - neyi tespit eder? Sonuçlar nasıl okunur? Testin fiyatı

PCR - sonuçlar. Yanlış pozitifler olabilir mi?

PCR son derece hassas bir yöntemdir ve aynı zamanda kontaminasyona karşı çok hassastır. Bu nedenle, PCR tabanlı testlerde yanlış pozitifleri ekarte etmek için uygun bir dahili kontrol seçmek çok önemlidir.

Önemli olan, test için doğru malzeme toplanması ve testi gerçekleştiren teşhis uzmanının deneyimi ve güvenilirliğidir.

PCR - sonuçlar. Yanlış negatif olabilirler mi

Herhangi bir laboratuvar testinde olduğu gibi, PCR yönteminde de yanlış negatif sonuçlar görünebilir. Burada uygun bir antikoagülan için kan toplamak çok önemlidir çünkü heparin gibi bazıları PCR reaksiyonunu inhibe edebilir.

Ayrıca, antibiyotik tedavisinin başlamasından sonra materyalin toplanması, PCR reaksiyonunun etkinliğinde bir azalmaya ve daha büyük bir yanlış negatif sonuç olasılığına neden olabilir.

Ayrıca Borrelia bakterilerinin kanda ve vücut sıvılarında çok kısa bir süre yaşadıkları da unutulmamalıdır, çünkü özel reseptörler sayesinde vücuttaki "ulaşılması zor" yerlere çok hızlı nüfuz ederler.

Bu nedenle, diğer mikroorganizmaların teşhisinin aksine, biyolojik materyaldeki Borrelia spiroketlerinin sayısı küçüktür, hatta bazen PCR yönteminin tespit sınırında bile. Bu aynı zamanda yanlış bir negatife de neden olabilir.

Önerilen makale:

Lenfosit transformasyon testi (LTT)

Edebiyat

1. Dunaj J. ve diğerleri, Lyme borreliosis tanısında PCR yönteminin önemi. Araştır Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
2. Kene kaynaklı hastalıkların laboratuar teşhisi Çalışma Grubunun Önerileri: Ulusal Laboratuvar Teşhisçileri Odası, Ulusal Halk Sağlığı Enstitüsü-Ulusal Hijyen Enstitüsü, Bulaşıcı hastalıklar alanında Ulusal Danışman, Bulaşıcı Hastalıklar ve Nöroenfeksiyonlar Bölümü, Białystok Tıp Üniversitesi, Polonya Viroloji Derneği, Varşova 2014.
3. Ružić-Sabljić E. ve Cerar T. Lyme hastalığının moleküler tanısında ilerleme. Uzman Rev Mol Diagn. 2017 Ocak; 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. et al. Tıbbi tanı alanlarında polimeraz zincir reaksiyonunun ilkeleri ve uygulamaları: bir inceleme. Braz J Microbiol. 2009 Ocak-Mart; 40 (1): 1-11.

Yazar hakkında

Karolina Karabin, MD, PhD, moleküler biyolog, laboratuvar teşhis uzmanı, Cambridge Diagnostics Polska, mikrobiyoloji alanında uzman biyolog ve laboratuvar çalışmalarında 10 yılı aşkın deneyime sahip laboratuvar teşhis uzmanı olarak eğitim almıştır. Moleküler Tıp Fakültesi mezunu ve Polonya İnsan Genetiği Derneği üyesi, Varşova Tıp Üniversitesi Hematoloji, Onkoloji ve İç Hastalıkları Bölümü Moleküler Tanı Laboratuvarı'nda araştırma bursları başkanı. Varşova Tıp Üniversitesi 1. Tıp Fakültesi'nde tıbbi biyoloji alanında tıp bilimleri doktoru unvanını savundu. Laboratuvar teşhisi, moleküler biyoloji ve beslenme alanında birçok bilimsel ve popüler bilim eserinin yazarı. Günlük olarak, laboratuvar teşhisleri alanında bir uzman olarak, Cambridge Diagnostics Polska'da temel departmanı yönetiyor ve CD Diyet Kliniğinde bir diyetisyen ekibi ile işbirliği yapıyor. Hastalıkların teşhisi ve diyet tedavisi konusundaki pratik bilgilerini konferanslarda, eğitimlerde, dergilerde ve web sitelerinde uzmanlarla paylaşmaktadır. Özellikle modern yaşam tarzının vücuttaki moleküler süreçler üzerindeki etkisiyle ilgileniyor.